Die Entschleierung des Unsichtbaren: Eine kurze Reise in die Fluoreszenzmikroskopie

Zellbeobachtung durch hochauflösende Bilder

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Fluoreszenzmikroskopie ist eine Untergruppe der Lichtmikroskopie und nutzt den Fluoreszenzeffekt, um Strukturen und Prozesse im Nanometerbereich sichtbar zu machen. Die Technik basiert auf Fluorochromen, die bei Anregung durch bestimmte Lichtwellenlängen Licht in einer anderen Farbe emittieren. Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie erstrecken sich über verschiedene wissenschaftliche Bereiche, darunter Biochemie, Biophysik und Medizin, und ermöglichen die Echtzeitbeobachtung verschiedener Zellkulturen. Folgender Blogbeitrag betrachtet die Bedeutung der Fluoreszenzmikroskopie in Life Science Anwendungen und beschreibt ihren allgemeinen Funktionsmodus.

Fluoreszenzmikroskopie - eine Untergruppe der Lichtmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie hebt sich als spannende Untergruppe innerhalb des Bereichs der Lichtmikroskopie hervor und bietet einzigartige Einblicke in die komplexe Welt zellulärer Strukturen. Durch die Nutzung des Phänomens der Fluoreszenz ermöglicht diese Technik Wissenschaftlern und Forschern, mit hoher Präzision in das mikroskopische Universum einzutauchen. Im Gegensatz zur herkömmlichen Lichtmikroskopie verwendet die Fluoreszenzmikroskopie Fluorochrome, Moleküle, die Licht bei Anregung durch bestimmte Wellenlängen emittieren. Dies verbessert nicht nur den Kontrast und die Sichtbarkeit, sondern ermöglicht auch die Visualisierung dynamischer Prozesse innerhalb lebender Zellen. Bei der Erkundung der Zellbeobachtung durch hochauflösende Bilder erweist sich die Fluoreszenzmikroskopie als leistungsstarkes Werkzeug, das die Geheimnisse zellulärer Funktionen und Verhaltensweisen auf einer zuvor unvorstellbaren Detailstufe enthüllt.

Optische Präzision für bessere Ergebnisse

Um optische Präzision in der Fluoreszenzmikroskopie zu gewährleisten, müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Die Optimierung der Strahlengänge ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass das Anregungslicht die Probe mit größtmöglicher Effizienz erreicht. Darüber hinaus ist die Auswahl und Integration genau passender Filter von großer Bedeutung, damit nur die gewünschten Wellenlängen zum Fluoreszenzsignal beitragen und so das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert wird. Die Anwendung hochwertiger Beschichtungen verfeinert optische Komponenten weiter und minimiert Reflexionen und Aberrationen, die die Bildklarheit beeinträchtigen könnten. In diesem komplexen Zusammenspiel optischer Elemente trägt jede Komponente synergetisch dazu bei, die Gesamtpräzision des Mikroskopiesystems zu erhöhen, was zu einer verbesserten Auflösung führt und komplizierte Messungen im Nanometerbereich ermöglicht.

Aufbau und Funktionsprinzip eines Fluoreszenzmikroskops

Abbildung 1 Funktionsprinzip eines Fluoreszenzmikroskops

Das Sichtbarmachen der Fluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskop wird durch spezielle Filter gewährleistet, die den Durchgang einzelner Wellenlängen ermöglichen. Zu den speziellen Filtern des Fluoreszenzmikroskops gehören:

Anregungsfilter,
Emissionsfilter und
dichroitischer Strahlteiler.

Individuelle Anregungsfilter lassen die jeweilige Wellenlänge des Lichtes passieren, die notwendig ist, um einen bestimmten Farbstoff in der zu untersuchenden Probe zu erregen. Der dichroitische Spiegel reflektiert die anregende Wellenlänge zum Objektiv, welches den Strahl auf das Präparat konzentriert. Das vom Präparat zurückgeworfene Licht bündelt sich im Objektiv und ist im erregten Zustand i.d.R. langwelliger, als das einfallende Licht. Den dichroitischen Spiegel durchlaufend, passiert das zurückgeworfene Licht den Emissionsfilter und wird auf die Wellenlänge der Emission reduziert. Rückstände des anregenden Lichtes, die noch nicht am dichroitischem Spiegel gestoppt wurden, werden am Emissionsfilter herausgefiltert. Im Idealfall trifft allein das Emissionslicht auf einen im Mikroskop verbauten Detektor und wird in der jeweiligen Farbe sichtbar.

Für optimale Messergebnisse bedarf es einer gleichmäßigen Ausleuchtung, besonders wenn ein großes Sichtfeld von mehreren Mikrometern oder Millimetern gefordert wird. Bei einer inhomogenen Ausleuchtung kann es z.B. zu einer ungleichmäßigen Aktivierung der zu untersuchenden Moleküle kommen. Die Folge: Die im Zentrum befindlichen Moleküle fluoreszieren stärker als solche, die sich in der Peripherie des einfallenden Beleuchtungsstrahls befinden. Ist die Periphere nicht äquivalent zum Zentrum ausgeleuchtet, kommt es weiterhin zu Schattierungen bei der späteren Zusammenführung der einzeln aufgenommenen Bild-Raster. Messungen, wie z.B. von Zell- und Gewebeproben, können folglich zu keiner zuverlässigen Analyse herangezogen werden.

Abbildung 2: Mit einem Gauß-Profil beleuchtete Messprobe (links) im Vergleich zu einer Beleuchtung mit einem Top-Hat-Profil (rechts). Das Top-Hat Profil sorgt für eine gleichmäßige Beleuchtung und damit für eine gleichmäßige Aktivierung der Moleküle sowie für ein randlos gestitchtes Bild mit minimaler Bildüberlappung. © CREOL

Probleme wie diese können durch das Einsetzen des Top-Hat Beam Shapers von asphericon, den a|TopShape, überwunden werden. Dieses kompakte System verwendet Asphären zur Strahlformung. Gaußsche Strahlen werden in ein gleichmäßiges Flat-Top-Profil transformiert und sorgen so für eine gleichmäßige Beleuchtung über das gesamte Sichtfeld. Die erzeugte Flachfeldbeleuchtung überzeugt durch eine hohe räumliche Kohärenz, unschlagbare optische Leistung und hohe Homogenität.

Fluoreszenzmikroskopie-Referenz

Wie im vorherigen Abschnitt gezeigt, können quantitative Analysen in der laserbasierten Fluoreszenzmikroskopie durch ungleichmäßige Beleuchtungen, z.B. verursacht durch Gauß’sche Strahlproﬁle, verkompliziert werden. Faktoren wie Lichtquelle und Beleuchtungsoptik beeinflussen die Gleichmäßigkeit. Diese Merkmale sind besonders herausfordernd, wenn ein großer Betrachtungsbereich (FOV) untersucht werden soll. Messbilder werden in der Fluoreszenzmikroskopie durch Bildraster erzeugt. Die einzelnen Bilder werden so aufgenommen, dass sich die Ränder überlappen und sie in der Nachbearbeitung zusammengesetzt werden können. Wenn die Beleuchtung ungleichmäßig ist, wird das endgültige Bild dunkle Ränder um jedes einzelne Bild haben - Messungen von Zell- und Gewebeproben werden unzuverlässig. Ein weiterer Nachteil ungleichmäßiger Beleuchtung: die ungleichmäßige Aktivierung von Molekülen. Diejenigen näher am Zentrum des Strahls fluoreszieren stärker als diejenigen am Rand (siehe Abb. 2).

Abbildung 3: (a) Schematische Darstellung der Strahlformung. (b) Experimenteller Aufbau. FFI wurde mit dem BeamExpander hinter dem TopShape um das 1,5-fache erweitert, um eine vollflächige Beleuchtung der Probe zu erreichen. © CREOL

Ein Forschungsteam des College of Optics and Photonics der University of Central Florida in Orlando (CREOL) konnte diese Probleme überwinden, indem es den a|TopShape und den a|BeamExpander von asphericon in ein Mikroskop-Setup integrierte (siehe Abb. 3). Das Flachfeldbeleuchtungs-Setup (FFI = flat-field illumination) formt Gauß’sche Strahlen in ein gleichmäßiges Flat-Top Profil. Der a|TopShape ist äußerst tolerant gegenüber Variationen in der Größe einfallender Laserstrahlen (± 10 %) und arbeitet achromatisch. Die sehr gute optische Leistung (Homogenität > 95 %) ermöglicht eine gleichmäßige Beleuchtung und somit Aktivierung der Moleküle. Darüber hinaus ermöglicht das FFI-Setup eine nahtlose Bildgebung ohne oder mit minimaler Bildüberlappung (5%).

Weitere Informationen zum Projekt finden Sie in unserer Referenzstory.

Über die Autorin

Als studierte Kommunikationswissenschaftlerin mit Erfahrungen im Bereich Personalmarketing und Eventmanagement kam Anna Polinski 2016 zu asphericon.