Modulátor svazku pro fluorescenční mikroskopii
Referenční projekt
Kvantitativní analýzy v laserové širokoúhlé fluorescenční mikroskopii
Analýza obrazů měření založená na laserové širokoúhlé fluorescenční mikroskopii se rychle stává neplatnou, pokud je založena na nerovnoměrně osvětlených profilech Gaussova svazku. Pomocí a|TopShape jsme poskytli zlepšení. Přeměna Gaussových paprsků v mikroskopickém zařízení výzkumného ústavu CREOL na homogenní flat-top profily zajišťuje rovnoměrné osvětlení diapozitivu a tím lépe čitelné snímky.
Detaily projektu
Kvantitativní analýzy v laserové fluorescenční mikroskopii jsou ztíženy nerovnoměrným osvětlením Gaussových profilů. Rovnoměrnost ovlivňuje mnoho faktorů, jako je zdroj světla a optika osvětlení. Tyto vlastnosti jsou miořádně náročné, pokud je FOV (zorné pole) v řádu několika stovek mikrometrů nebo milimetrů velké. Obrazy měření jsou generovány ve fluorescenční mikroskopii pomocí obrazových mřížek. Jednotlivé snímky jsou pořizovány tak, že se okraje překrývají a následně je lze poskládat. Pokud osvětlení není rovnoměrné, výsledný složený obraz bude mít kolem každého jednotlivého obrazu tmavé okraje. Měření vzorků buněk a tkání se tak stává nespolehlivé. Další nevýhodou nerovnoměrného osvětlení je nerovnoměrná aktivace molekul. Ty, které jsou nejblíže středu paprsku, fluoreskují silněji než ty na okraji.
Realizace projektu
Tým výzkumníků z College of Optics and Photonics na University of Central Florida v Orlandu na Floridě/USA dokázal tyto problémy překonat použitím asférického modulátoru svazku a|TopShape a a|BeamExpander ve svém nastavení mikroskopu ( Obr. b). Oba produkty jsou vyrobeny z vysoce přesných asférických čoček, jsou velmi kompaktní a mají refrakční efekt. Tímto způsobem bylo možné zkonstruovat sestavu pro flat-field illumination (FFI), která formuje Gaussův paprsek do jednotného flat-top profilu (a). Tvarovač paprsku a|TopShape je extrémně tolerantní vůči kolísání velikosti příchozího laserového svazku a přijímá ± 10 %. Funguje achromaticky (e). Dlouhá pracovní vzdálenost (f) a vysoká prostorová koherence FFI umožnily rovnoměrné Epi (osvětlení a detekce z jedné strany vzorku) a TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) osvětlení pro vícebarevné zobrazení jedné molekuly. Nepřekonatelný optický výkon použitých komponentů s homogenitou > 95% zajišťuje rovnoměrné osvětlení (c & d) a tím rovnoměrnou aktivaci molekul. Nastavení FFI navíc umožňuje bezokrajové sešívané zobrazování s minimálním překrýváním obrazu (5 %).
Experimentální charakterizace FFI
Obrázky:
(a) Schéma modulace svazku.
(b) Experimentální uspořádání. FFI bylo rozšířeno 1,5x pomocí BeamExpander za TopShape, aby bylo zajištěno plné osvětlení zorného pole vzorku.
(c) Profily paprsků Gaussových svazků kolimovaných čočkou s ohniskovou vzdáleností 80 mm nebo 150 mm a paprsky FFI bez a s clonou.
(d) Průřezy z profilů nosníků v (c) podél přerušovaných čar. Svislé přerušované čáry v (d) označují oblast detekce fotoaparátu.
(e) Závislost FFI na vlnové délce excitace. Řezy převzaté z vícebarevných obrázků (vložek) s duhovkou.
(f) Závislost na pracovní vzdálenosti FFI s laserem 638 nm.
Stručný pohled na optiku pro CREOL:
- a|TopShape a a|BeamExpander umožňují transformaci Gaussových svazků do plochého top-hat profilu a tím rovnoměrné osvětlení sklíčka
- Homogenita osvětlení: > 95 %
Další infromace: I. Khaw, B. Croop, J. Tang, A. Moehl, U. Fuchs, K. Y. Han: „Flat-field illumination for quantitative fluorescence imaging“, In: OPTICS EXPRESS, Vol. 26, No. 12, 11 Jun 2018, pp. 15276-15288
Zjistěte více o principu našeho modulátoru svazků a|TopShape at: asphericon.com/cs/solutions/products/beamtuning/beam-shaping/
