Strahlformer für Fluoreszenzmikroskopie
Referenzprojekt
Quantitative Analysen in der bildgebenden Fluoreszenzmikroskopie
Die Analyse von Messbildern basierend auf der lasergestützten bildgebenden Fluoreszenzmikroskopie wird schnell invalide, wenn diese auf ungleichmäßig ausgeleuchteten Gaußschen Strahlprofilen basieren. Die Verwendung des a|TopShape konnte hier Abhilfe schaffen. Eine Umformung der Gauß Strahlen in einem Mikroskopie Set-ups des Forschungsinstituts CREOL in homogene Flat-Top Profile sorgt für eine gleichmäßige Ausleuchtung des Objektträgers und damit für besser lesbare Bilder.
Projektdetails
Quantitative Analysen in der laserbasierten Fluoreszenzmikroskopie werden durch die ungleichmäßige Ausleuchtung von Gaußschen Profilen erschwert. Viele Faktoren, wie Lichtquelle und Beleuchtungsoptiken, beeinflussen die Gleichmäßigkeit. Diese Merkmale sind besonders anspruchsvoll, wenn ein großes FOV (Field of view) in der Größenordnung von mehreren hundert Mikrometern oder Millimetern untersucht werden soll. Die Messbilder werden in der Fluoreszenzmikroskopie durch Bildraster generiert. Einzelne Bilder werden so aufgenommen, dass sich die Ränder überlappen und sie anschließend in der Nachbearbeitung zusammengesetzt werden können. Wenn die Beleuchtung nicht gleichmäßig ist, hat das finale zusammengesetzte Bild abgedunkelte Ränder um jedes einzelne Bild. Messungen von Zell- und Gewebeproben werden so unzuverlässig. Ein weiterer Nachteil der ungleichmäßigen Beleuchtung ist die ungleichmäßige Aktivierung der Moleküle. Diejenigen, die dem Zentrum des Strahls am nächsten sind, fluoreszieren stärker, als diejenigen in der Nähe der Peripherie.
Projektrealisierung
Ein Forscherteam des College of Optics and Photonics, der University of Central Florida in Orlando, Florida/USA, konnte diese Probleme überwinden, indem es asphericons Strahlformer a|TopShape und den a|BeamExpander in seinem Mikroskopaufbau verwendete (Abb. b). Beide Produkte bestehen aus hochpräzisen Asphären, sind sehr kompakt und wirken refraktiv. Auf diese Weise konnte ein Set-up zur Flachfeldbeleuchtung (kurz FFI für flat-field illumination) aufgebaut werden, das den Gaußstrahl zu einem gleichmäßigen Flat-Top Profil formt (a). Der Strahlformer a|TopShape ist extrem tolerant gegenüber Größenschwankungen des eintreffenden Laserstrahls und akzeptiert ± 10 %. Dabei arbeitet er achromatisch (e). Der lange Arbeitsabstand (f) und die hohe räumliche Kohärenz der FFI ermöglichten eine gleichmäßige Epi- (= Beleuchtung und Detektion von einer Seite der Probe) und TIRF-Beleuchtung (= Abkürzung für Total Internal Reflection Fluorescence) für die mehrfarbige Einzelmolekülabbildung. Die unschlagbare optische Leistung der verwendeten Komponenten, mit einer Homogenität > 95%, ermöglicht eine gleichmäßige Ausleuchtung (c & d) und damit die gleichmäßige Aktivierung der Moleküle. Darüber hinaus ermöglicht das FFI Set-up eine randlose gestitchte Bildgebung mit minimaler Bildüberlappung (5%).
Experimentelle Charakterisierung der FFI
Abbildungen:
(a) Schematische Darstellung der Strahlformung.
(b) Experimenteller Aufbau. FFI wurde mit dem BeamExpander hinter dem aTopShape um das 1,5-fache erweitert, um eine vollständige FOV-Beleuchtung der Probe zu erreichen.
(c) Strahlprofile von Gaußstrahlen, kollimiert durch eine Linse mit 80 mm oder 150 mm Brennweite und FFI-Strahlen ohne und mit Blende.
(d) Querschnitte aus den Strahlenprofilen in (c) entlang gestrichelter Linien. Vertikale gestrichelte Linien in
(d) zeigen den Erfassungsbereich der Kamera.
(e) Abhängigkeit der Anregungswellenlänge von FFI. Querschnitte aus Mehrfarbenbildern (Inserts) mit einer Blende.
(f) Arbeitsabstandsabhängigkeit von FFI mit 638 nm Laser.
Optiken für CREOL auf einen Blick:
- a|TopShape und a|BeamExpander ermöglichen Umformung der Gauß Strahlen in flache TopHat-Profile und damit die gleichmäßige Ausleuchtung des Objektträgers
- Homogenität der Ausleuchtung: > 95 %
Weiterführende Informationen: I. Khaw, B. Croop, J. Tang, A. Moehl, U. Fuchs, K. Y. Han: „Flat-field illumination for quantitative fluorescence imaging“,
In: OPTICS EXPRESS, Vol. 26, No. 12, 11 Jun 2018, pp. 15276-15288
Mehr über das Prinzip unseres Strahlformers a|AiryShape erfahren Sie unter: asphericon.com/loesungen/produkte/beamtuning/strahlformung/
