Odhalení neviditelného: Krátká cesta do fluorescenční mikroskopie

Pozorování buněk pomocí vysoce rozlišených snímků

Obsah

Doba čtení: 5 min - Slova: 892

Fluorescenční mikroskopie, podskupina světelné mikroskopie, využívá efekt fluorescence k vizualizaci struktur a procesů v nanometrovém měřítku. Tato technika spoléhá na fluorochromy, které po excitaci specifickými vlnovými délkami světla vyzařují světlo jiné barvy. Aplikace fluorescenční mikroskopie zasahují do různých vědeckých oblastí, včetně biochemie, biofyziky a medicíny, a umožňují pozorování rozmanitých kultur v reálném čase. Následující blogový příspěvek se zaměřuje na význam fluorescenční mikroskopie v aplikacích věd o živé přírodě a popisuje její obecný princip fungování.

Fluorescenční mikroskopie – podskupina světelné mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie vyniká jako fascinující podskupina světelné mikroskopie, která nabízí jedinečný pohled do složitého světa buněčných struktur. Využitím fenoménu fluorescence umožňuje tato technika vědcům a výzkumníkům zkoumat mikroskopický vesmír s mimořádnou přesností. Na rozdíl od tradiční světelné mikroskopie používá fluorescenční mikroskopie fluorochromy – molekuly, které po excitaci specifickými vlnovými délkami vyzařují světlo. To nejen zvyšuje kontrast a viditelnost, ale také umožňuje vizualizaci dynamických procesů v živých buňkách. Při zkoumání buněk pomocí vysoce rozlišených obrazů se fluorescenční mikroskopie ukazuje jako mocný nástroj, který odhaluje tajemství buněčných funkcí a chování v dříve nepředstavitelné míře detailu.

Optická přesnost pro lepší výsledky

Zlepšování optické přesnosti ve fluorescenční mikroskopii zahrnuje pečlivé zohlednění více faktorů. Optimalizace drah paprsků je nezbytná k zajištění toho, aby excitační světlo dopadlo na vzorek s maximální účinností. Důležitý je také výběr a integrace přesně padnoucích filtrů, které propouštějí pouze požadované vlnové délky a tím zvyšují poměr signálu k šumu. Použití vysoce kvalitních povlaků dále zdokonaluje optické komponenty, minimalizuje odrazy a aberace, které by mohly zhoršit čistotu obrazu. V této složité souhře optických prvků každý komponent přispívá synergicky ke zvýšení celkové přesnosti mikroskopického systému, což vede k lepšímu rozlišení a usnadňuje detailní měření v nanometrovém měřítku.

Komponenty fluorescenčního mikroskopu

Obrázek 1: Princip fungování fluorescenčního mikroskopu

Vizualizace fluorescence ve fluorescenčním mikroskopu je zajištěna speciálními filtry, které umožňují průchod jednotlivých vlnových délek. Speciální filtry fluorescenčního mikroskopu zahrnují:

excitační filtry
emisní filtry
dichroický dělič paprsku

Jednotlivé excitační filtry propouštějí takovou vlnovou délku světla, která je nezbytná k excitaci konkrétní barvicí látky ve zkoumaném vzorku. Dichroické zrcadlo odráží stimulační vlnovou délku k objektivu, který soustředí paprsek na preparát. Světlo odražené od vzorku se soustředí v objektivu a ve svém excitovaném stavu má obvykle delší vlnovou délku než dopadající světlo. Při průchodu dichroickým zrcadlem prochází odražené světlo emisním filtrem a redukuje se na emisní vlnovou délku. Zbytky stimulačního světla, které nebyly zachyceny dichroickým zrcadlem, jsou odfiltrovány v emisním filtru. Ideálně tak na detektor vestavěný do mikroskopu dopadá pouze emisní světlo, které se zobrazí v příslušné barvě.

Optimální výsledky měření vyžadují rovnoměrné osvětlení, zejména když je požadováno velké zorné pole o rozměrech několika mikrometrů či milimetrů. V případě nerovnoměrného osvětlení může například docházet k nerovnoměrné aktivaci zkoumaných molekul. Výsledek: molekuly ve středu fluoreskují silněji než ty na periferii dopadajícího paprsku (viz obr. 2). Pokud periferie není osvětlena stejně jako střed, vzniká při pozdějším spojování jednotlivých obrazových polí stínování. Takto pořízené snímky buněčných a tkáňových vzorků proto nelze použít k spolehlivé analýze.

Obrázek 2: Měřicí vzorek osvětlený Gaussovým profilem (vlevo) ve srovnání s osvětlením pomocí profilu Top-Hat (vpravo). Top-Hat zajišťuje rovnoměrné osvětlení a tím jednotnou aktivaci molekul i bezproblémové spojování obrazů s minimálním překryvem. © CREOL

Problémy tohoto typu lze překonat použitím tvarovače paprsku Top-Hat a|TopShape od společnosti asphericon. Tento kompaktní systém využívá asféry pro tvarování paprsku. Jeho použití umožňuje transformaci Gaussova paprsku na rovnoměrný Flat-Top profil a tím zajišťuje homogenní osvětlení v celém zorném poli. Generované osvětlení s plochým polem přesvědčí vysokou prostorovou koherencí, vynikajícím optickým výkonem a vysokou homogenitou.

Fluorescenční mikroskopie – reference

Jak ukázala předchozí část, kvantitativní analýzy v laserové fluorescenční mikroskopii mohou být komplikovány nerovnoměrným osvětlením generovaným Gaussovými profily paprsků. Rovnoměrnost je ovlivněna faktory, jako jsou světelný zdroj a osvětlovací optika. Tyto vlastnosti jsou obzvláště náročné při zkoumání velkého zorného pole (FOV). Ve fluorescenční mikroskopii se měřicí obrazy získávají ve formě obrazových polí. Jednotlivé snímky se pořizují tak, aby se okraje překrývaly, a následně se skládají v post-processingu. Pokud je osvětlení nerovnoměrné, bude výsledný obraz vykazovat ztmavené okraje kolem každého dílčího snímku – měření buněčných a tkáňových vzorků se stává nespolehlivým. Další nevýhoda nerovnoměrného osvětlení: nerovnoměrná aktivace molekul. Ty, které se nacházejí blíže středu paprsku, fluoreskují více než ty na jeho okraji (viz obr. 2).

Obrázek 3: (a) Schéma tvarování paprsku. (b) Experimentální sestava. FFI bylo zvětšeno 1,5× použitím BeamExpanderu za TopShape, aby se zajistilo plné osvětlení vzorku v zorném poli. © CREOL

Výzkumný tým z College of Optics and Photonics, University of Central Florida v Orlandu (CREOL), dokázal tyto problémy překonat integrací tvarovače paprsku a|TopShape a expandéru a|BeamExpander od společnosti asphericon do mikroskopické sestavy (viz obr. 3). Konfigurace Flat-Field Illumination (FFI) přetváří Gaussovy paprsky na rovnoměrný Flat-Top profil. a|TopShape je extrémně tolerantní vůči variacím ve velikosti vstupních laserových paprsků (± 10 %) a pracuje achromaticky. Velmi dobrý optický výkon (homogenita > 95 %) umožňuje rovnoměrné osvětlení a tím i aktivaci molekul. Navíc konfigurace FFI umožňuje spojování obrazů bez okrajů s minimálním překryvem (5 %).

Více informací o projektu naleznete v naší referenční studii.

O autorovi

Anna Polinski, absolventka komunikačních věd se zkušenostmi v oblasti HR marketingu a event managementu, nastoupila do společnosti asphericon v roce 2016.