荧光显微技术

用于细胞观察的光束整形元件、滤光片和二向色分束器

荧光显微镜属于光学显微镜家族。基于荧光的物理效应，它利用了所谓的荧光染料的颜色特性，被特定波长的光激发，并以不同的波长将吸收的光再次反射回来。

荧光显微镜的应用

荧光显微镜能够实时观察大多数不同培养物的形态研究、纳米范围内的测量值分析和过程。无论是在生物化学领域，还是在医学领域，快速而详细地检测明亮多彩的荧光，有助于提高荧光显微镜的测量效果，并产生新的发现。

最佳的测量结果和最佳的分辨率需要最精确的光学元件，包括优化和聚焦光束路径的透镜、精准安装滤光片以及高质量的镀膜。

平顶光照明在宽场荧光显微镜中的作用

图1：平顶光束的示例性波前测量

宽场荧光显微镜与荧光显微镜的不同之处在于其照明和成像技术。传统的荧光显微镜用广谱的光照射整个样本并收集整个视场发出的荧光，而宽视场荧光显微镜使用特定的照明模式，如平顶光进行照明（见图1），可以确保均匀和可控的曝光。这种聚焦照明可以生成更高的对比度、减少光漂白以及改进图像质量，使得宽场荧光显微镜在需要跨视场精确和均匀照明的应用中特别有利。该技术在生物、生物医学和材料研究中至关重要，可提供细胞结构和动态过程的高分辨率可视化。它的成功取决于照明质量，影响数据的准确性、灵敏度和再现性。

高斯光照明的挑战

虽然激光器因其卓越的性能而广受欢迎，但高斯激光束在宽领域应用中面临挑战。不均匀的强度分布（见图左2）使数据分析复杂化，并导致光漂白和光毒性等问题，特别是在活细胞成像中有害。

平顶光照明的优势

平顶光照明是高斯光的替代方案，可以提供均匀的强度分布，最大限度地减少伪影并增强图像对比度。这解决了与光漂白和光毒性相关的挑战，确保了荧光团的一致保存和样品的生存能力。均匀的光分布加速了数据采集和分析，简化了荧光显微镜实验（见图2右）。

图2：如图所示，使用高斯光（左）照明的测量样本与使用平顶光（右）照明的样本进行比较，具有不同的强度分布。平顶光提供均匀的照明，从而实现分子的均匀激活，以及图像重叠最小的无边界缝合成像。©CREOL

创建平顶光束

有几种方法可以创建平顶光束，包括截断光束、空间光调制器（SLM）和光束整形光学元件。截断光束的方式虽然具有成本效益，但也有功耗等缺点。SLM提供精确性，但复杂且成本高昂。光束整形光学元件，特别是定制设计的非球面透镜，以最小的光学损耗提供均匀的平顶光束。

Figure 3a: 'Cutting off' the beam (truncation)

Figure 3b: Sspatial Light Modulator (SLM)

Figure 3c: Beam shaping optics

先进成像技术的应用

平顶光照明显著受益于超分辨率显微镜和全内反射荧光（TIRF）显微镜等先进技术。在超分辨率显微镜中，它提高了定位精度和分辨率。在TIRF显微镜中，均匀的照明确保了一致的倏逝场，提高了研究细胞膜或界面附近分子相互作用的准确性。

（宽场）荧光显微镜的非球面解决方案

在宽视场荧光显微镜中采用平顶光照明，可提高图像质量、样品完整性和实验效率。非球面光束整形解决方案，例如a|TopShape，为用户实现平顶光束提供了可靠且友好的选择：

更多关于宽场荧光显微镜中平顶光照明的信息，请参阅我们的博客文章
“为什么你应该在宽视场荧光显微镜中使用平顶光照明”.

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