成像荧光显微术中的定量分析

如果基于不均匀照射的高斯光束轮廓,基于激光辅助成像荧光显微术的测量图像分析很快变得无效。使用a|TopShape可以在这个方面提供帮助。在CREOL研究所的显微镜装置中将高斯光束转换成均匀的平顶轮廓确保了载玻片的均匀照明,从而获得更清晰可辨的图像。

项目详情

基于激光的荧光显微术中的定量分析由于高斯轮廓的不均匀照明而变得更加困难。许多因素,如光源和照明光学元件,都会影响均匀性。当需要研究几百微米或毫米量级的大FOV(视场)时,这些特征尤其具有挑战性。测量图像通过图像网格在荧光显微镜中生成。以边缘重叠的方式拍摄单个图像,然后可以在后期处理中将它们放在一起。如果照明不均匀,最终的合成图像在每个单独的图像周围会有暗边。细胞和组织样本的测量因此变得不可靠。不均匀照明的另一个缺点是分子的不均匀激活。最靠近光束中心的荧光比周围的荧光更强。

项目实现

美国佛罗里达奥兰多中佛罗里达大学光学和光子学院的一组研究人员通过在其显微镜设置中使用asphericon的a|TopShape光束整形器和|光束扩展器,能够克服这些问题(图b)。两款产品均采用高精度非球面透镜,非常小巧,具有折射效果。通过这种方式,可以构建平场照明(FFI)装置,将高斯光束形成均匀的平顶轮廓(a)。a|TopShape光束整形器对入射激光束的尺寸波动具有极高的容忍度,可接受±10%的波动。它可以消色差(e)。FFI的长工作距离(f)和高空间相干性为多色单分子成像提供了均匀的Epi(从样品一侧进行照明和检测)和TIRF(全内反射荧光)照明。所用部件无与伦比的光学性能(均匀度>95%),提供均匀的照明(c和d),从而均匀地激活分子。此外,FFI设置支持无边界拼接成像,图像重叠最小(5%)。

FFI的实验表征

图:

(a)光束成形的示意图。

(b)实验设置。FFI已通过aTopShape后面的BeamExpander扩展1.5倍,以实现样品的完整FOV照明。

(c)高斯光束的光束轮廓,由焦距为80mm或150mm的透镜和具有和不具有光圈的FFI光束准直。

(d)(c)中沿着虚线的光束轮廓的横截面。

(d)中的垂直虚线表示摄像机的检测范围。

(e)激发波长对FFI的依赖性。带光圈的多色图像(插页)的横截面。

(f)使用638nm激光时工作距离对FFI的依赖性。

CREOL光学元件概览:

  • a|TopShape和a|BeamExpander能够将高斯光束转换为平顶顶帽轮廓,从而对载玻片进行均匀照明
  • 光照均匀度:>95%

Further information: I. Khaw, B. Croop, J. Tang, A. Moehl, U. Fuchs, K. Y. Han: „Flat-field illumination for quantitative fluorescence imaging“, In: OPTICS EXPRESS, Vol. 26, No. 12, 11 Jun 2018, pp. 15276-15288

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