Fluoreszenz
mikroskopie
Die Fluoreszenzmikroskopie zählt zur Familie der Lichtmikroskopie und basiert auf dem physikalischen Effekt der Fluoreszenz. Dabei werden die Farbeigenschaften der sogenannten Fluorochrome ausgenutzt, die durch Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden und das absorbierte Licht mit veränderter Wellenlänge wieder zurückstrahlen.
Morphologische Untersuchungen, Analysen von Messwerten im Nanometerbereich und in Echtzeit sichtbar werdende Vorgänge verschiedenster Kulturen werden mit der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Ob im Bereich der Biochemie, der Biophysik oder der Medizin: Eine schnelle und detailreiche Detektion von hellen, farbenreichen Floreszenzen erleichtert den Messvorgang der Fluoreszenz-Mikroskopie und bildet die Grundlage für neue Erkenntnisse. Für optimale Messergebnisse und beste Auflösung bedarf es präzisester Optiken - sei es durch die Optimierung und Fokussierung von Strahlengängen, passgenaue Filter oder hochwertige Beschichtungen.
Das Sichtbarmachen der Fluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskop wird durch spezielle Filter gewährleistet, die den Durchgang einzelner Wellenlängen ermöglichen. Zu den speziellen Filtern des Fluoreszenzmikroskops gehören:
Individuelle Anregungsfilter lassen die jeweilige Wellenlänge des Lichtes passieren, die notwendig ist, um einen bestimmten Farbstoff in der zu untersuchenden Probe zu erregen. Der dichroitische Spiegel reflektiert die anregende Wellenlänge zum Objektiv, welches den Strahl auf das Präparat konzentriert. Das vom Präparat zurückgeworfene Licht bündelt sich im Objektiv und ist im erregten Zustand i.d.R. langwelliger, als das einfallende Licht. Den dichroitischen Spiegel durchlaufend, passiert das zurückgeworfene Licht den Emissionsfilter und wird auf die Wellenlänge der Emission reduziert. Rückstände des anregenden Lichtes, die noch nicht am dichroitischem Spiegel gestoppt wurden, werden am Emissionsfilter herausgefiltert. Im Idealfall trifft allein das Emissionslicht auf einen im Mikroskop verbauten Detektor und wird in der jeweiligen Farbe sichtbar.
Für optimale Messergebnisse bedarf es einer gleichmäßigen Ausleuchtung, besonders wenn ein großes Sichtfeld von mehreren Mikrometern oder Millimetern gefordert wird. Bei einer inhomogenen Ausleuchtung kann es z.B. zu einer ungleichmäßigen Aktivierung der zu untersuchenden Moleküle kommen. Die Folge: Die im Zentrum befindlichen Moleküle fluoreszieren stärker als solche, die sich in der Peripherie des einfallenden Beleuchtungsstrahls befinden. Ist die Periphere nicht äquivalent zum Zentrum ausgeleuchtet, kommt es weiterhin zu Schattierungen bei der späteren Zusammenführung der einzeln aufgenommenen Bild-Raster. Messungen, wie z.B. von Zell- und Gewebeproben, können folglich zu keiner zuverlässigen Analyse herangezogen werden. Probleme wie diese können durch das Einsetzen des a|TopShape und des a|BeamExpanders überwunden werden. Ermöglicht wird dies durch die in den Systemen verbauten Asphären, die sowohl durch ihre kompakte Bauweise als auch durch ihre Präzision und höchste optische Qualität überzeugen. Der Einsatz der optischen Komponenten a|TopShape und a|BeamExpander ermöglicht die Umformung des Gauss-Strahls zu einem einheitlichen Flat-Top-Profil und damit die gleichmäßige Ausleuchtung über das gesamte Sichtfeld. Die generierte Flat-Field-Illumination überzeugt durch eine hohe räumliche Kohärenz, unschlagbare optische Leistung sowie durch eine hohe Homogenität von > 95 %. Die gleichmäßige Anregung der Moleküle und minimale Bildüberlappungen (5%) können zu Ihrer vollsten Zufriedenheit garantiert werden.
Folgende Grafik zeigt das Funktionsprinzip und allgemeinen Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops.
Quantitative Analysen innerhalb der laserbasierten Fluoreszenzmikroskopie können durch ungleichmäßige Ausleuchtungen, erzeugt durch Gaußsche Strahlprofile, erschwert werden. Faktoren, wie Lichtquelle und Beleuchtungsoptiken, beeinflussen die Gleichmäßigkeit. Diese Merkmale sind besonders anspruchsvoll, wenn ein großes Sichtfeld (Field of view) untersucht werden soll. Messbilder werden in der Fluoreszenzmikroskopie durch Bildraster generiert. Die einzelnen Bilder werden dabei so aufgenommen, dass sich die Ränder überlappen und sie anschließend in der Nachbearbeitung zusammengesetzt werden können. Ist die Beleuchtung ungleichmäßig, hat das finale Bild abgedunkelte Ränder um jedes einzelne Bild - Messungen von Zell- und Gewebeproben werden unzuverlässig. Weiterer Nachteil der ungleichmäßigen Beleuchtung: die ungleichmäßige Aktivierung der Moleküle. Diejenigen, die dem Zentrum des Strahls am nächsten sind, fluoreszieren stärker, als diejenigen am Rand.
Ein Forscherteam am College of Optics and Photonics, der University of Central Florida in Orlando, konnte diese Probleme überwinden, indem es aphericons Strahlformer a|TopShape und den a|BeamExpander in einen Mikroskop-Aufbau integrierte. Das Set-up zur Flachfeldbeleuchtung (kurz FFI für flat-field illumination) formt Gaußstrahlen zu einem gleichmäßigen Flat-Top Profil um. Der a|TopShape ist extrem tolerant gegenüber Größenschwankungen eintreffender Laserstrahlen (± 10 %) und arbeitet achromatisch. Die sehr gute optische Leistung (Homogenität > 95%) ermöglicht eine gleichmäßige Ausleuchtung und damit auch Aktivierung der Moleküle. Darüber hinaus ermöglicht das FFI Set-up eine randlose gestitchte Bildgebung mit minimaler Bildüberlappung (5%).
Weitere Informationen zum Projekt erhalten Sie in unserer Referenzstory.
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Der a|TopShape ist ein innovativer Strahlformer, der kollimierte Gaußstrahlen in kollimierte Top-Hat Strahlen umwandelt.
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